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Um novo estudo revisado por pares levanta preocupações sobre os métodos usados para testar possíveis impurezas de DNA na vacina Comirnaty COVID-19 mRNA produzida pela Pfizer e BioNTech.
No estudo publicado este mês na revista Methods and Protocols, os investigadores alemães Brigitte König e Jürgen O. Kirchner questionaram a confiabilidade da técnica quantitativa de PCR (qPCR) que a Pfizer-BioNTech utilizou para medir a contaminação do DNA na substância ativa da vacina.
Os pesquisadores fizeram experiências com a dissolução das nanopartículas lipídicas da Comirnaty. Eles encontraram níveis de impureza de DNA variando de 360 a 534 vezes superiores ao limite de 10 ng (nanograma) por dose estabelecido pelos reguladores em todo o mundo.
Os pesquisadores propuseram que os métodos de espectroscopia de fluorescência poderiam quantificar de forma mais confiável os níveis totais de contaminação de DNA presentes no produto final da vacina, pronto para uso.
Kevin McKernan, diretor científico e fundador da Medicinal Genomics, disse ao The Defender que, embora os autores tenham levantado alguns pontos cruciais em relação à contaminação de DNA nas vacinas de mRNA da COVID-19, os corantes fluorométricos podem não ser confiáveis, levando a leituras inflacionadas.
‘Uma enorme subdetecção de impurezas de DNA’
Fabricantes como a Pfizer-BioNTech utilizam testes de contaminação de DNA que se baseiam num método qPCR aplicado à substância ativa da vacina antes de esta ser combinada com nanopartículas lipídicas.
König e Kirchner apontaram que o teste qPCR procura apenas um pequeno segmento de 69 pares de bases do modelo original de DNA de 7.824 pares de bases usado para produzir a vacina de mRNA.
Isto significa que a Pfizer verifica menos de 1% do modelo original. Os outros 99% não são analisados, resultando em “uma enorme subdetecção de impurezas de DNA”, afirmaram.
Os investigadores também argumentaram que este pequeno segmento pode ser destruído a taxas diferentes do resto dos fragmentos do modelo de DNA durante o processo de digestão enzimática, confundindo ainda mais as medições precisas.
Outro fator complicador é que a sequência alvo do qPCR se sobrepõe a uma seção de DNA chamada promotor T7 usada para produzir o mRNA. Maquinaria celular ou subprodutos podem se ligar a esta região promotora, impedindo que ela seja detectada pelo teste qPCR.
David Speicher, Ph.D., coautor com McKernan e outros de um estudo pré-impresso sobre fragmentos de DNA nas vacinas COVID-19 da Moderna e da Pfizer, expressou preocupações semelhantes.
A PCR pode quantificar apenas uma sequência específica de DNA/RNA alvo dos primers usados, disse ele ao The Defender. Se houver alguma quebra ou mutação nessa sequência alvo, o “DNA não será amplificado e as cargas serão subnotificadas”.
“Também existe a suposição de que o DNA da vacina provém apenas do plasmídeo e não de origem bacteriana ou de qualquer outra fonte”, disse Speicher.
McKernan apontou outro problema: os reguladores permitem que a Pfizer use qPCR para medir o DNA e fluorometria para medir o RNA.
“Os regulamentos da EMA [Agência Europeia de Medicamentos] são uma medição raciométrica de RNA/DNA”, disse ele. “As proporções não devem ser medidas em polegadas para RNA e metros para DNA.”
Ele disse que a Pfizer deveria medir tanto o RNA quanto o DNA usando fluorometria ou qPCR. “Quando eles permitem que misturem e combinem ferramentas como essa, eles permitem o engano evidente.”
McKernan também compartilhou uma parte do pedido de patente da Moderna reconhecendo que o qPCR é inadequado para medir pequenos fragmentos de DNA.
‘Não estamos mais debatendo se as vacinas estão contaminadas’
Para evitar as armadilhas do qPCR, que visa apenas uma pequena fração do DNA contaminante, König e Kirchner propuseram o uso de técnicas de espectroscopia de fluorescência como o Qubit para quantificar os níveis totais de DNA no produto final da vacina.
Estes métodos empregam corantes fluorescentes que se ligam especificamente a ácidos nucleicos como DNA e RNA.
Seus experimentos usando a técnica de fluorescência com Comirnaty encontraram contaminação de DNA significativamente superior ao limite de 10 ng/dose após a quebra das nanopartículas.
Figura 2. Quantificação de DNA total em lotes de Comirnaty usando fluorometria Qubit sem e com adição de Triton-X-100 como detergente para desintegrar as nanopartículas lipídicas contidas na formulação da vacina. Crédito: Brigitte König e Jürgen O. Kirchner.
McKernan, que escreveu sobre as limitações da fluorometria em seu Substack, pediu cautela ao considerar os resultados de König e Kirchner.
“Os corantes fluorométricos podem interagir entre o RNA e o DNA, de modo que grandes quantidades de RNA presentes na vacina acionarão o corante específico do DNA para fornecer algum sinal do RNA”, disse ele ao The Defender. “Isso está levando a leituras inflacionadas do DNA no artigo de König.”
Para resolver esta preocupação, McKernan disse que os pesquisadores deveriam realizar um controle de RNase. A RNase é uma enzima que apaga o RNA, portanto não há interferência do RNA ao medir o DNA.
Sem este controle, König e Kirchner “deixaram uma superfície de ataque fácil para os seus críticos”, disse ele.
Na pesquisa em preparação para publicação, McKernan disse que vários laboratórios que realizaram experimentos com RNase observaram uma redução de 10 vezes no sinal de DNA observado ao usar a fluorometria.
“Isso ainda deixa a contaminação do DNA bem acima do limite da FDA [US Food and Drug Administration]”, disse McKernan. Ele enfatizou que a sua “crítica contundente” ao estudo não deveria diminuir ou inviabilizar o apelo para reavaliar os protocolos de testes de contaminação de DNA para vacinas de mRNA.
“Não estamos mais debatendo se as vacinas estão contaminadas”, disse ele. “Estamos apenas debatendo se eles estão 10 ou 100 vezes acima do limite e o quanto variam de lote para lote.”
Riscos potenciais de contaminação de DNA
König e Kirchner citaram preocupações de que níveis de contaminação de DNA superiores ao esperado poderiam ser absorvidos pelas células humanas durante a vacinação, com consequências desconhecidas se esse ADN se integrar no genoma.
Eles citaram o “risco de mutagênese insercional”, onde segmentos de DNA estranhos interrompem sequências genéticas normais quando inseridos no genoma, possivelmente levando a mutações e doenças associadas como o câncer.
Pesquisadores como McKernan já determinaram que o DNA nas vacinas de mRNA COVID-19 inclui o gene promotor do câncer do vírus símio 40 (SV40) e sequências de DNA do plasmídeo de E. coli que sobraram do processo de produção da vacina.
Numa apresentação em fevereiro na conferência International Crisis Summit-5, McKernan destacou que o pedido de patente da Moderna para a sua vacina de mRNA COVID-19 reconheceu os riscos da mutagênese de inserção.
O mesmo pedido de patente afirma que a contaminação do DNA pode causar câncer:
“O modelo de DNA utilizado no processo de fabricação de mRNA deve ser removido para garantir a eficácia da terapêutica e segurança, porque o DNA residual em medicamentos pode induzir a ativação da resposta inata e tem potencial para ser oncogênico em populações de pacientes.”
McKernan afirmou na sua apresentação na Cimeira Internacional de Crise que “estamos sempre com câncer”. Ele propôs a seguinte “hipótese de três acertos” sobre os impactos negativos das vacinas de mRNA na saúde:
- Aumento da mutagênese com contaminação por plasmídeo dsDNA [DNA de fita dupla].
- Os efeitos da N1-metil-pseudouridinausada para estabilizar o RNA, causando linfocitopenia, neutropenia , doenças relacionadas à IgG4, etc.
- A inibição dos “guardiões do genoma”, os genes supressores de tumor P53e BRCA1.
Regulamentações sobre contaminação de DNA ‘totalmente inadequadas para o propósito’
McKernan sublinhou que os atuais regulamentos que regem o limite permitido de contaminação de DNA em vacinas são “totalmente inadequados para a sua finalidade”.
“O público deve saber que as diretrizes de contaminação por DNA presumiam uma meia-vida de 5 a 10 minutos do DNA nu no sangue”, disse ele. “Uma vez que este DNA é protegido por nanopartículas lipídicas, ele não fica mais nu e não se degrada, mas sim transfecta suas células.”
De acordo com McKernan, os fragmentos de DNA de mamíferos fazem parte de um “vetor de terapia genética altamente replicativo projetado para produzir mais de si mesmo” e, portanto, pode se autoamplificar indefinidamente uma vez transfectado.
“De que adianta um limite de 10 ng se a indústria farmacêutica puder inserir uma molécula de DNA amplificável através dessa regulamentação?” ele perguntou.
Os reguladores estabeleceram a permissão de contaminação de DNA de 10 ng/dose em 1998.
“10 ng é uma consideração extracelular”, disse Karl Jablonowski, Ph.D., cientista pesquisador sênior da Children’s Health Defense. “Se você perguntasse quanto DNA estranho deveria ser permitido dentro do núcleo, a resposta seria zero”, disse ele ao The Defender.
Speicher acrescentou que os reguladores ignoram fragmentos com menos de 200 pares de bases porque estes provavelmente não seriam problemáticos se o DNA permanecesse fora das nossas células.
Para uma perspectiva, com o DNA em todo o genoma humano com uma média de 6,41 pc (picogramas), Jablonowski observou que “10 ng de DNA é o nosso genoma inteiro 1.560 vezes”.
‘Quão imprudentes eles podem ser com o genoma humano?’
Apesar das possíveis limitações, os reguladores europeus aprovaram o método qPCR para verificar se a Comirnaty cumpre os limites exigidos de contaminação de ADN de 10 ng/dose.
De acordo com König e Kirchner, além dos testes qPCR do ingrediente ativo do fabricante, “nenhuma quantificação experimental adicional de DNA é realizada para a vacina”.
Os reguladores afirmam que testar o produto final não é viável, citando a potencial interferência das nanopartículas lipídicas que encapsulam o mRNA.
No entanto, os investigadores salientaram que os fabricantes podem quantificar com precisão o mRNA nessas mesmas nanopartículas. Eles criticaram os reguladores por confiarem nos dados limitados de qPCR dos fabricantes e por não exigirem a quantificação direta do DNA total no produto final da Comirnaty.
Depois de outros cientistas replicarem o trabalho de McKernan, agências reguladoras como a FDA, a EMA e a Health Canada foram obrigadas a reconhecer a presença do SV40 nas vacinas da Pfizer.
No entanto, de acordo com McKernan, estas agências sustentaram que os fragmentos de DNA são demasiado pequenos em comprimento e quantidade para serem funcionais e não tomaram medidas para regular ainda mais ou retirar as vacinas do mercado.
McKernan também destacou que antes da Lei Nacional de Lesões por Vacinas Infantis de 1986 (NCVIA), o limite de contaminação por DNA era 1.000 vezes inferior ao limite atual de 10 ng.
Este afrouxamento das regulamentações, juntamente com o escudo de responsabilidade da NCVIA e os avanços tecnológicos, tornou a tecnologia de sequenciamento de DNA “100.000 vezes mais barata”, disse ele, permitindo que as empresas de vacinas adicionassem “reagentes de transfecção [como LNPs] para garantir que esse DNA entre em suas células, pode se autoamplificar e mexer nos circuitos celulares.
McKernan disse:
“Por que a FDA não sequencia essas vacinas? Que desculpa eles têm para não saberem a sequência e frequência precisas de cada molécula de DNA e RNA numa vacina que planeiam injetar em milhares de milhões de pessoas? Quão imprudentes eles podem ser com o genoma humano?”
Apesar da aparente inação da agência, um recente pedido da Lei de Liberdade de Informação feito por um cidadão canadense revelou “atividade alarmante nos bastidores”, de acordo com McKernan.
“Os reguladores estão dizendo ao público para não se preocupar com a contaminação, mas sim para lutar internamente para que esse DNA seja removido”, disse ele.